本文目录
- .Primer5.0软件使用的优点及缺点
- 引物的设计软件
- Beacon Designer 7软件除了设计qRT-PCR的引物以外，还能设计普通PCR(产物大于500bp)的引物吗
- PCR的引物怎样设计,
- 如何利用Primer6.0进行引物的设计
.Primer5.0软件使用的优点及缺点
优点：操作简单。缺点：不能保存分析结果。
Primer5.0软件优点：操作简单、显示各种参数的改变和可能的二聚体、异二聚体、发夹结构等。缺点：不能保存分析结果，只能选择打印。
PrimerPremier引物设计软件是一款加拿大Premier公司推出的引物设计应用软件，可以用来PCR或测序引物以及杂交探针的设计，快捷简单方便，不过是英文版，它主要由4个部分组成，分别是序列窗口、引物设计窗口、酶切分析窗口、纹基分析窗口。
引物的设计软件
■Oligo 6
Oligo 6是目前使用最为广泛的一款引物设计软件，除了可以简单快捷地完成各种引物和探针的设计与分析外，还具有很多其他同类软件所不具有的高级功能：
● 已知一个PCR引物的序列，搜寻和设计另一个引物的序列；
●按照不同的物种对MM子的偏好性设计简并引物；
● 对环型DNA片段，设计反向PCR引物；
●设计多重PCR引物；
●为LCR反应设计探针，以检测某个突变是否出现；
●分析和评价用其他途径设计的引物是否合理；
●同源序列查找，并根据同源区设计引物；
●增强了的引物/探针搜寻手段。设计引物过程中，可以Lock每个参数，如Tm值范围和引物3’端的稳定性等；
● 以多种形式存储结果；支持多用户，每个用户可保存自己的特殊设置。
■Primer Premier 5.0
Primer Premier 5.0 是一种用来帮助研究人员设计最适合引物的应用软件利用它的高级引物搜索引物数据库巢式引物设计引物和分析等功能可以设计出有高效扩增能力的理想引物也可以设计出用于扩增长达50kb以上的PCR产物的引物序列。
该软件主要由GeneTank 序列，Primer引物设计，Align 序列比较，Enzyme 酶切分析和Motif 基序分析等几个主要功能板块组成。
Beacon Designer 7软件除了设计qRT-PCR的引物以外，还能设计普通PCR(产物大于500bp)的引物吗
Beacon Designer是一款比较强大的引物设计兼检索和Blast功能的软件，不仅可以设计一般的引物，还可以进行普通RT-PCR，Taqman Probe，Beacon Probe等多种引物的设计，软件操作是傻瓜式的，设计引物要求和PP7.0等软件无异，每款软件的help里都有软件的详细应用，希望对你有用！
PCR的引物怎样设计,
PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列.因此,引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否.
要设计引物首先要找到DNA序列的保守区.同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构.如这个区域单链能形成二级结构,就要避开它.如这一段不能形成二级结构,那就可以在这一区域设计引物.
现在可以在这一保守区域里设计一对引物.一般引物长度为15~30碱基,扩增片段长度为100~600碱基对.
让我们先看看P1引物.一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%.而且四种碱基的分布最好随机.不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在.否则P1引物设计的就不合理.应重新寻找区域设计引物.
同时引物之间也不能有互补性,一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补.
引物确定以后,可以对引物进行必要的修饰,例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等,这对扩增的特异性影响不大.但3′端绝对不能进行任何修饰,因为引物的延伸是从3′端开始的.这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位,因为密码子第3位易发生简并,会影响扩增的特异性与效率.
综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则：
① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性.
② 产物不能形成二级结构.
③ 引物长度一般在15~30碱基之间.
④ G+C含量在40%~60%之间.
⑤ 碱基要随机分布.
⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补.
⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补.
⑧ 引物5′端可以修饰.
⑨ 引物3′端不可修饰.
⑩ 引物3′端要避开密码子的第3位.
PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列.如前述,引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否.对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功,但遵循某些原则,则有助于引物的设计.
1.引物的特异性
引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源.
2.避开产物的二级结构区
某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响,选择扩增片段时最好避开二级结构区域.用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构,有助于选择模板.实验表明,待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时,扩增往往不能成功.若不能避开这一区域时,用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的.
3.长度
寡核苷酸引物长度为15~30bp,一般为20~27mer.引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T+,Ln值不能大于38,因为》38时,最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性.
4.G+C含量
G+C含量一般为40%~60%.其Tm值是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度,有效启动温度,一般高于Tm值5~10℃.若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为55~80℃,其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳.
5.碱基础随机分布
引物中四种碱基的分布最好是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在.尤其3′端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发.
6.引物自身
引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性.这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合.若用人工判断,引物自身连续互补碱基不能大于3bp.
7.引物之间
两引物之间不应不互补性,尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成.一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性.
8.引物的3′端
引物的延伸是从3′端开始的,不能进行任何修饰.3′端也不能有形成任何二级结构可能,除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中,引物3′端不能发生错配.
在标准PCR反应体系中,用2U Taq DNA聚合酶和800μmol/L dNTP（四种dNTP各200μmol/L）以质粒（103拷贝）为模板,按95℃,25s；55℃,25s；72℃,1min的循环参数扩增HIV-1 gag基因区的条件下,引物3′端错配对扩增产物的影响是有一定规律的.A∶A错配使产量下降至1/20,A∶G和C∶C错七下降至1/100.引物A：模板G与引物G：模板A错配对PCR影响是等同的.
9.引物的5′端
引物的5′端限定着PCR产物的长度,它对扩增特异性影响不大.因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性.引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等.
10.密码子的简并
如扩增编码区域,引物3′端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增特异性与效率.
特殊目的的引物设计将在有关章节讨论.随着人们对引物的认识,一些引物的计算机设计程序也应运而生,下面将讨论有关引物计算机设计方法.
现有的引物设计软件有primer5.0比较好.
如何利用Primer6.0进行引物的设计
1.首先，选取目的基因序列，对格式没有什么要求，只需要将目的基因序列复制就可以。
2.打开File目录下的New，选择Sequence。这里的另一个Project选项是导入文件的方式，也就是将目的基因以文件形式保存的可以直接导入文件。一般通过复制的方式会更方便。
3.打开Sequence后，会弹出粘贴框，只需要将刚刚复制的基因序列粘贴上即可，然后点击下方的Add。
4.选择上方的红蓝双向箭头的按钮进行引物设计，在设计开始前可以更改设计的参数，包括搜索的碱基范围、引物的长度，碱基数，设计结果显示的引物对数等。
5.设置完参数后，点击下方的Search，软件开始分析设计，完成后，点击OK。设计结果就会在下面显示出来。
6.结果中蓝色为前引物，红色为后引物，Rating是对引物的综合评价分数，在上方也会显示引物的优劣，最好的为Best，中等为Good，最次的为Poor。一般选择引物都为Best或Good，其它显示均是无法使用的。
7.在右边还有两个选项，All Primers可以查看可选择的多对不同引物。可以根据需要选择合适位置和适当产物长度的引物。选择后需要点击下方的Replace才能替换。
8.All Structers则可以查看当前选定引物的结构，如发夹结构，引物二聚体和重复碱基等。
9.引物选定完成后，点击下方的引物序列，再右键会弹出复制信息选项，进而将设计好的引物导出。也可以直接以文件的形式将结果导出。
