本文目录
细菌基因编辑的基本工具与原理
1. 位点特异性基因重组系统 Cre-lox 重组系统和FLP-FRT 重组系统都是位点特异性基因重组技术。Cre-lox 系统来源于大肠杆菌（Escherichia coli）P1 噬菌体，可以促使噬菌体DNA插入到细菌基因组中。Cre 为重组酶，可以识别长度为34 bp 具有方向性的loxP 位点。同一DNA分子上同向的两个loxP 位点发生重组，可以删除两个loxP 位点之间的DNA 片段；同一DNA 分子上反向的两个loxP 位点发生重组，可以使两个loxP 位点之间的DNA 片段发生倒置；具有单个loxP 位点的环状DNA 序列与第二个DNA 分子的loxP 位点发生重组，可以将环状序列插入到第二个DNA 分子的loxP 位点上。loxP 位点在自然界基因组中出现的概率极低，因此在进行基因时，首先要在受体基因组上引入loxP 位点，再诱导Cre 重组酶的表达并催化loxP 位点之间发生重组。在细菌基因中，Cre-lox 重组系统常用作删除选择标记基因、大片段基因的删除和倒置等。Cre 重组酶发挥作用不需要任何辅助因子，Cre-lox 重组系统具有广谱性，理论上可以在任何细胞环境的任何类型DNA 分子上发挥有效作用。Flp-FRT 系统是Cre-lox 系统在真核细胞内的同源系统，与Cre-lox 系统的工作原理极为相似，Flp 为重组酶，识别具有方向性的FRT 位点。 2.同源重组系统 λ-Red 同源重组系统包含3 个来源于λ 噬菌体Red 操纵子的基因，其中λ Gam 蛋白抑制RecBCD酶的活性，以保护外源线性DNA 免受降解。λ Exo是以双链DNA（Double-stranded DNA，dsDNA） 为底物的核酸外切酶，可以催化5’-3’ 方向的降解，而产生3’-5’ 的线性单链DNA（single-stranded DNA，ssDNA）， 当dsDNA 的一条链被降解后， 产生的ssDNA 将不会被λ Exo 降解。λ Beta 蛋白可以结合在ssDNA 上起到保护作用，引导同源配对促进同源重组的发生。RecE/T 重组系统与λ-Red 同源重组系统作用机制类似，RecE 蛋白发挥与λ Exo 蛋白相似的功能，RecT 蛋白发挥与λ Beta 蛋白相似的功能。RecE/T 系统缺少RecBCD 酶的抑制蛋白。进行基因时，在细菌中引入两端具有与受体基因组DNA同源片段的外源dsDNA 分子，借助于λ-Red 重组系统或RecE/T 重组系统，诱发同源片段中间的外源DNA 序列与基因组序列发生交换，从而可实现基于同源重组的基因。传统的λ-Red 同源重组系统是在细菌中引入dsDNA，Ellis 等在2001 年提出利用70-90 bp 长度的ssDNA 为底物可以简化λ-Red 系统，不需要λExo 介导的产生单链的过程。目前比较接受的机制为退火学说（Strand annealing），即无论是在细菌中引入同源dsDNA 后通过λ Exo 外切酶产生的ssDNA，还是在细菌中直接引入的ssDNA，都会在λ Beta 蛋白保护和介导下以冈崎片段的方式结合到DNA 复制过程中的后随链上，产生一个野生型基因组和一个异源双链的基因组。随后具有异源双链基因组的细菌细胞再经过一次DNA 复制和细胞分裂产生一个野。生型基因组和一个突变型基因组。 3.靶向核酸酶 包含之前提到过的ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9系统，这里就不多介绍了。
CRISPR/Cas系统介绍
Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas)9 系统成功被改造为第三代人工核酸内切酶，与锌指核酸内切酶(zinc finger endonuclease，ZFN)和类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-likeeffector nuclease，TALEN)一样可用于各种复杂基因组的。该技术成功应用于人类细胞、斑马鱼和小鼠以及细菌的基因组精确修饰，修饰类型包括基因定点改造、多位点同时改造等。由于其突变效率高、制作简单及成本低的特点，被认为是一种具有广阔应用前景的基因组定点改造分子工具。 对于CRISPR/Cas 的作用机理可以分为三个阶段来理解，第一是CRISPR 的高度可变的间隔区的获得，第二是CRIPSR 基因座的表达(包括转录和转录后的成熟加工)，第三是CRISPR/Cas 系统活性的发挥或者是对外源遗传物质的干扰。 CRISPR 的高度可变的间隔区(spacer)获得，其实就是指外来入侵的噬菌体或是质粒DNA 的一小段DNA 序列被整合到宿主菌的基因组，整合的位置位于CRRSPR 的5’ 端的两个重复序列之间(repeats)．因此，CRISPR 基因座中的间隔序列从5’ 到3’ 的排列也记录了外源遗传物质入侵的时间顺序．噬菌体或是质粒上与间隔序列对应的序列被称为protospacer，通常protospacer 的5’ 或是3’ 端延伸几个碱基序列很保守， 被称为PAM(protospacer adjacent motifs)，它的长度一般为2～5碱基，一般与protospacer 相隔1～4 碱基．新间隔序列的获得可能分为三步：首先识别入侵的核酸和扫描外源DNA 潜在的PAM，将临近PAM 的序列作为候选protospacer；然后在CRISPR 基因座的5’ 端合成重复序列；最后新的间隔序列整合到两个重复序列之间．目前只有第一个步骤被证实，Cas1 和Cas2 蛋白是负责新间隔序列获得的核心蛋白．另外研究发现TypeⅡ CRISRP/ Cas 系统中Csn2 蛋白对于新的间隔序列的获得也是必需的。 CRISPR 基因座首先被转录成前体CRISPR RNA(pre-crRNA)，然后在Cas 蛋白或是核酸内切酶的作用下被剪切成一些小的RNA 单元，这些小RNA 即为成熟crRNA，由一个间隔序列和部分重复序列组成，TypeⅡ型CRISPR/Cas系统crRNA 的成熟除了需要Cas9 和RNaseⅢ参与以外，还需要tracrRNA 的指导．CRISPR 基因座在没有受到外界压力的情况下表达水平很低．当外源的质粒或是噬菌体入侵宿主菌时CRISPR 的表达很快被诱导上调。 干扰是CRISPR/Cas 发挥抵御外源遗传物质入侵最关键的步骤，成熟的crRNA 与特异的Cas 蛋白形成核糖核蛋白复合物，再与外源DNA 结合并扫描到外源DNA，寻找其上的靶序列，crRNA 的间隔序列与靶序列互补配对，外源DNA 在配对的特定位置被核糖核蛋白复合物切割．早期研究认为crRNA 的间隔序列(spacer)与外源DNA 的靶位点完全互补配对对于切割是必需的，但是后来的研究证明spacer 与protospacer 部分互补配对时切割也可以发生。
